I.     DASAR TEORI 
Biological Oxygen Demand (BOD) atau Kebutuhan Oksigen Biologic (KOB) adalah suatu analisa empiric yang mencoba mendekati secara global proses-proses mikrobiologis yang benar-benar terjadi di dalam air. Angka BOD ada­lah jumlah oksigen yang dibutuhkan oleh bakteri untuk menguraikan (meng­oksidasikan) hampir semua zat organis yang terlarut dan sebagian zat-zat or­ganis yang tersuspensi dalam air. Pemeriksaan BOD diperlukan untuk menentukan beban pencemaran akibat air buangan penduduk atau industri, dan untuk mendisain sistem-sis­tem pengolahan biologic bagi air yang tercermar tersebut. Penguraian zat or­ganis adalah peristiwa alamiah; kalau sesuatu badan air dicemari oleh zat organis , bakteri dapat menghabiskan oksigen terlarut, dalam air selama, pro­ses oksidasi tersebut yang bisa mengakibatkan kematian ikan-ikan dalam air dan keadaan menjadi anaerobik dan dapat menimbulkan bau busuk pads air tersebut.Jenis bakteri yang mampu mengoksidasi zat organis "biasa," yang ber­asal dari sisa-sisa tanaman dan air buangan penduduk, berada pads umumnya di setiap air alam. Jumlah bakteri ini tidak banyak di air jernih dan di air buangan industri yang mengandung zat organis. Pada kasus ini pasti perlu ditambahkan benih bakteri. Untuk oksidasi/penguraian zat organis yang khas, terutama di beberapa jenis air buangan industri yang mengandung mi­salnya fenol, detergen, minyak dan sebagainya bakteri harus diberikan "waktu penyesuaian" (adaptasi) beberapa hari melalui kontak dengan air buangan tersebut, sebelum dapat digunakan sebagai benih pads analisa BOD air tersebut.Sebaliknya beberapa zat organis maupun inorganic dapat bersifat ra­cun terhadap bakteri (misalnya sianida, tembaga, dan sebagainya) dan ha­rus dikurangi sampai batas yang diinginkan. Derajat keracunan ini juga da­pat diperkirakan melalui analisa BOD.Prinsip AnalisaPemeriksaan BOD didasarkan atas reaksi oksidasi zat organis dengan oksigen di dalam air, dan proses tersebut berlangsung karena adanya bakteri aerobik. Sebagai hasil oksidasi akan terbentuk karbon dioksida, air dan amoniak. Reaksi oksidasi dapat dituliskan sebagai berikut :Atas dasar  reaksi tersebut, yang memerlukan kira-kira 2 hari di mana 50 % reaksi telah tercapai, 5 hari supaya 75 % dan 20 hari supaya 100 % tercapai, maka pemeriksaan BOD dapat dipergunakan untuk menaksir beban pence­maran zat organis . Tentu saja, reaksi (1) juga berlangsung pada badan air su­ngai, air danau maupun di instalasi pengolahan air buangan yang menerima air buangan yang mengandung zat organis tersebut. Dengan kata lain, tes BOD berlaku sebagai simulasi (berbuat seolah-olah terjadi) sesuatu proses biologis secara alamiah.Reaksi biologis pada tes BOD dilakukan pada temperatur inkubasi 20° C dan dilakukan selama 5 hari, hingga mempunyai istilah yang lengkap BOD (angka 20 berarti temperatur inkubasi dan angka 5 menunjukkan lama waktu inkubasi), namun di beberapa literatur terdapat lama inkubasi 6 jam atau 2 hari atau 20 hari*.Demikian, jumlah zat organis yang ada di dalam air diukur melalui jum­lah oksigen yang dibutuhkan bakteri untuk mengoksidasi zat organis tersebut. Karena reaksi BOD dilakukan di dalam botol yang tertutup, maka jum­lah oksigen yang telah dipakai adalah perbedaan antara, kadar oksigen di da­lam larutan pada saat t = 0 (biasanya barn ditambah oksigen dengan aerasi, hingga = ^{9 mg} 02 /E, yaitu konsentrasi kejenuhan) dan kadarnya pads t = 5 hari (konsentrasi sisa harus ->- 2 mg ₀₂ j agar supaya hasil cukup teliti). Oleh karena itu, semua sampel yang mengandung BOD > 6 mg ₀₂ /f harus dien­cerkan supaya syarat tersebut terpenuhi.

GangguanAda 5 jenis gangguan yang umumnya terdapat pada analisa BOD aitu nitrifikasi, zat beracun, kemasukan udara pada botolnya, kekurangan nutrient (garam) dan kekurangan bakteri yang dibutuhkan proses tersebut. Gangguan-gangguan tersebut akan diuraikan di bawah ini :a.       Proses nitrifikasi dapat mulai terjadi di dalam botol BOD setelah 2 sampai 10 hari : NH3 amoniak berubah menjadi NO3- )nitrat) lewat NO2- (nitrit) olh jenis bakteri tertentu.b.      Zat beracun dapat memperlambat pertumbuhan bakteri (yaitu memper­lambat reaksi BOD) bahkan membunuh organisme tersebut. Kalau zat tersebut memang sangat beracun hingga bakteri-bakteri ti­dak bisa hidup same sekali atau sukar berkembang, maka hanya sebagian jumlah bakteri akan aktip dalam oksidasi zat organis tersebut, hingga BOD yang tercatat akan lebih rendah dari angka BOD sesuatu sampel yang tidak mengandung zat beracun. Contoh zat beracun adalah Cr (VI) (bukan Cr (III) Hg, Pb, CN^-- (sianida), clan sebagainya, yang konsentra­sinya melampaui sesuatu kadar yang tertentu (biasanya sangat kecil). Gambar 10.2. menunjukkan efek zat racun terhadap pertumbuhan bak­teri. Kategori zat lain, seperti misalnya fenol dan bermacam-macam se­nyawa organis asal minyak tanah, tidak beracun sekali; namun akan memperlambat permulaan. proses BOD karena hanya se­bagian kecil dari jumlah benih bakteri mampu mengoksidasi zat organic tersebut hingga perkembangan populasi jenis bakteri khusus yang diper­lukan (cocok) menjadi terhambat. Kadang-kadang zat organic tersebut memang dapat beracun terhadap beberapa jenis bakteri saja. Pada kasus ini, sebelum tes BOD harus diadakan mass penyesuaian jenis-jenis bakteri terhadap racun (adaptasi).c.               Kemasukan (atau keluarnya) oksigen dari botol selama waktu inkubasi harus dicegah. Botolnya harus ditutup dengan hati-hati (di atas tutup bo­tol bisa diberi air (water seal); gelembung udara tidak boleh berada da­lam botol; gelembung udara dapat di keluarkan dengan mengetuk botol. Juga ganggang dan lumut dapat menambah atau mengurangi kadar ok­sigen secara tak teratur. Oleh karena itu pads waktu inkubasi botol BOD harus di simpan di tempat gelap.d.             Nutrien merupakan salah satu syarat bagi kehidupan. bakteri-bakteri. Nu­trien terbentuk dari bermacam-rAacam garam (Fe, K, Mg, dan sebagai­nya). Biasanya sampel sendiri (air buangan penduduk, air sungai) me­ngandung cukup nutrien, tetapi zat tersebut kadang-kadang kurang da­lam air buangan industri sebelum proses berlangsung. Karena kekurangan nutrien tersebut sukar diduga, maka sebaiknya pads setiap botol BOD di­tambah nutrien secukupnya sebelum mass inkubasi, yaitu pads seat t = 0.e.       Karena benih dari bermacam-macam bakteri dapat kurang jumlahnya atau kurang cocok bagi jenis air buangan yang akan dianalisa, maka cara pembenihan pads butir A2.2. selalu harus diikuti dengan baik, hingga menjamin jumlah populasi bakteri yang diperlukan (cocok).Catatan :Kalau sampel BOD mengandung zat racun, pertumbuhan bakteri terhalai (inhibisi) maka angka BOD rendah. Namun, hal ini tidak mempengaruhi an lisa COD yang tidak tergantung dari pertumbuhan bakteri (lihat jugs Bab 5 "COD"). Oleh karena itu perbandingan BOD₅ /COD dapat menunjukkan ad nya gangguan tersebut (analisa BOD dan COD saling melengkapi).Cara lain untuk mendeteksi gangguan tersebut adalah pengenceran car pel supaya dosis zat beracun dapat berada di bawah konsentrasi yang berb hays; memang cara ini terbatas karena kadar oksigen terlarut dalam same terbatas, hingga pengenceran maksimum yang diperbolehkan adalah kira-kira 10 kali.

Tabel 10.1 menunjukkan nilai perbandingan angka BOD₅ dengan COD untuk beberapa jenis air dan air buangan
Batas deteksi, ketelitian.

Hasil BOD₅ diperbolehkan menyimpang dari harga yang sebenarnya sebes plus atau min 5 %, untuk seseorang yang telah berpengalaman. Hasil antara dua laboratorium atau lebih, dapat berbeda ± 10 %. Analisa BOD selalu akan, kurang tepat, namun demikian analisa ini sangat penting karena mencerminkan proses alam yang hampir sama dengan kenyataan. Penyimpangan dise­babkan oleh adanya proses-proses mikrobiologis yang kurang dapat diatur oleh manusia, serta kesulitan pads analisa zat oksigen yang terlarut dalam sampel. Apabila sampel diencerkan maka ketelitian analisa zat oksigen ter­larut semakin buruk.
Pengambilan dan pengawetan sampel.
Sampel BOD harus dilakukan/dimulai paling lama 2 jam setelah pengambilan sampelnya (karena proses biologis terns berlangsung dalam botol sampel se­hingga BOD akan turun secara otomatis). Kalau hal ini tidak mungkin, sam­pel harus disimpan pads ± 4~C (kulkas atau tabung isotermik/terisolasi yang pakai es biasa atau es _CO2 kering) selama paling lama 24 jam. Sampel bisa disimpan lebih lama sebagai es di dalam freezer, tetapi ketelitian analisa semakin buruk, hingga tidak merupakan anjuran.I.              ALAT DAN BAHAN PERCOBAANPipet Ukur (Measuring Pippete)

Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar.Untuk keperluan analisa BOD menggunakan DO meter dalam analisa oksigen terlarut, pipet ukur digunakan untuk mengambil larutan sampel jika diperlukan pengenceran untuk kemudian dipindahkan ke wadah yang diinginkan (tabung ukur, Erlenmeyer, dll). Jika analisa oksigen terlarut dengan metode titrasi Winkler, pipet digunakan untuk mengambil larutan seperti larutan mangan sulfat, alkali iodide azida, dan asam sulfat pekat.

Silinder (tabung ukur/ gelas ukur/ Graduated Cylinder)



Bentuk: Berupa gelas yang agak tinggi dengan perincian tercantum pada dinding.
Volum tersedia: dari 10 ml – 2000ml. Bahan: terbuat dari kaca biasa atau plastik sehingga tidak dapat dipanaskan.
Kegunaan: untuk memindah atau mengukur volum cairan dengan ketelitian sedang. Di dalam analisa BOD, gelas ukur digunakan sebagai tempat larutan hasil pengenceran.Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan.     
                               
Gelas Arloji



Digunakan untuk menimbang berat suatu zat padat dalam pembuatan reagen atau larutan jika analisa oksigen terlarut menggunakan titrasi Winkler.

Buret



Bentuk : sebuah tabung kaca bergaris yang mempunyai kran diujungnya untuk mengeluarkan volume cairan tertentu dengan debit berupa tetes.Volume tersedia: 25ml atau 50 ml dengan interval 0,1ml, satu tetes yang keluar dari ujung buret ± setara dengan 0,03ml.
Cara penggunaan : bilas buret dua kali dengan cairan yang diisi ke dalam buret, pengisian buret dilakukan dari atas dengan corong, gerakkan kran untuk mengatur volume air buret ke gelas erlenmeyer. Ketika membaca buret, mata harus tegak lurus dengan permukaan cairan dan dibaca pada meniskus cekung cairan.Di dalam analisa BOD, buret digunakan untuk melakukan titrasi jika pengukuran oksigen terlarut dilakukan dengan metode Titrasi Winkler.

Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)



Bahan: terbuat dari kaca borosilikat yang tahan panas sehingga dinding yang tipis untuk memudahkan pemindahan panas dan mengurangi tegangan termis.
Volum tersedia: 20-2000ml; skala volum yang tercantum pada dinding gelas tidak teliti sama sekali dan merupakan petunjuk kasar saja.
Kegunaan: sebagai tempat titrasi digunakan gelas erlenmeyer yang lehernya lebar, sehingga walau digoyangkan, titran tetap dapat menetes dengan mudah ke dalamnya. Di dalam analisa DO, Erlenmeyer digunakan untuk standardisasi tiosulfat.

Labu takar



Bentuk: pada dinding labu takar tercantum kode “ln” atau ‘TC’ = To Contain, juga tercantum perincian sama seperti pada dinding pipet.
Volume tersedia: dari 20-2000 ml.
Kegunaan: untuk mengukur volum cairan yang tertentu atau untuk membuat larutan atau pengenceran larutan dengan kadar yang tepat.Cara menggunakan: sebelum digunakan, labu takar harus dibilas dahulu dengan air suling, kemudian dibilas dua kali dengan jenis cairan yang akan diisi ke dalam labu takar tersebut, volum cairan tepat sama dengan yang tercantum pada dinding labu takar, bila meniskus cairan menyentuh tanda garis leher labu takar.

Botol BOD (Winkler)



Bentuk: seperti botol biasa, dengan tutup pasangannya.Volume tersedia: 250 ml-300 ml.Bahan: terbuat dari kaca biasa atau kaca borosilikat.Kegunaan: untuk analisa BOD dan oksigen terlarut.Cara menggunakan: dasar tutup dibuat miring agar botol BOD dapat diisi sampai penuh tanpa ada gelembung udara yang terperangkap di dalamnya. Ada jenis botol yang dilengkapi water seal yaitu di sekitar mulut botol dan atas tutup dapat diberi sedikit air suling guna mencegah masuknya udara.

Inkubator BODInkubator BOD adalah inkubator yang khusus digunakan untuk analisa BOD. Suhu yang disediakan adalah 20ºC dengan penyimpangan ±1ºC
.

Dissolved Oxygen meter (alat pengukur oksigen terlarut)



Cara penggunaan: Sebelum digunakan, DO meter dikalibrasi dahulu dengan mengukur kelembaban dengan meletakkan ujung alat di atas permukaan aquadest, ukur DOnya dan hasil harus mendekati 100% dengan penyimpangan ± 3%, setelah itu dilakukan pengecekan dengan menggunakan larutan Natrium Tio sulfat yang diketahui konsentrasinya, hasil pengukuran harus tepat dengan penyimpangan ±3%. Kemudian dikalibrasi lagi dengan aquadest seperti tahan awal. Jika hasilnya baik, alat layak digunakan. Perlu pengadukan dengan stirer atau alat digoyangkan pelan-pelan ke dalam sampel agar larutan menjadi homogen. Setelah beberapa saat, angka digital akan berjalan sampai keluar hasil yang konstan. Biasanya dinyatakan dalam mg/l.

I.         CARA KERJAAlat-alata.     Botol-botol inkubasi Winkler (terbuat dari kaca) 250 -- 320 ml di mana volumnya diketahui dengan tepat, karena tercantum pads botolnya* botol tersebut dapat memakai tutup khusus lingkar air (water seal), teta­pi biasanya dasar tutupnya membentuk kerucut supaya kelebihan air dan gelembung udara dapat dihilangkan dengan mudah;
b.     Inkubator : suhu terjamin 20 ± 1⁰ C; gelap;
c.   4 labu takar 1 liter; 3 labu takar 2 liter; bermacam-macam pipet; kalau tersedia, dispenser otomatis;
d.   Peralatan bagi analisa oksigen terlarut (lihat bagian B dan C Bab ini).Reagen.a.   Air suling : tidak boleh mengandung zat beracun, seperti Cr, C1₂ , dan se­bagainya.
b.   Larutan bufer fosfat     Larutkan ke dalam labu takar 1 liter yang berisi ± 500 ml air suling, 8,5 g ^KH2 ^PO4, 21,75 g K, ^HPO4, 33,4 g Na_{t HPO4.} 7 H₂ 0, dan 1,7 g NH₄ Cl Kemudian encerkan dengan air suling sampai menjadi 1,000 liter; sesuai­kan pH-nya sampai pH 7,2 dengan asam HCI atau basa NaOH 0,1 atau I N.c.     Larutan magnesium sulfat :     Larutkan ke dalam labu takar 1 liter yang berisi ± 500 ml air suling 22,5 g ^{Mg SO}4^. 7H₂0 dan encerkan dengan air suling sampai menjadi 1,000 liter.d.     Larutan kalsium klorida    Larutkan ke dalam labu takar 1 liter yang berisi ± 500 ml air suling, 27,5 g _CaC12 dan encerkan dengan air suling sampai menjadi 1,000 liter.e.     Larutan feriklorida :     Larutkan ke dalam labu takar 1 liter yang berisi ± 500 ml air suling 0,25 g FeC1₃. 6 H₂0 dan encerkan dengan air suling sampai menjadi 1,000 liter. Larutan b sampai dengan e harus diganti kalau endapan atau lumut telah muncul.f.    Larutan basa NaOH atau KOH, dan asam HCl atau ^1-12 SO4 1 N untuk menetralkan sampel air yang bersifat asam atau basa sampai pH-nya ber­kisar antara 7,0 dan 7,6.g.     Bubuk inhibitor nitrifikasi     N-Serve (Dow Chemicals), allyltio-ureum (ATU) (Merck) atau Nitrifica­tion Inhibitor 2533 (Hach Chem. Co).h. Benih    Ambil ± 10 g tanah yang subur, yang dapat ditanami, yang tidak mengan­dung zat beracun seperti pestisida; demikian pH-nya antara 6 dan 7,5. Campur tanah tersebut dengan ± 100 ml air sampel yang akan diperiksa (atau kalau BOD nya > 1000 mg/1, encerkan sampel lebih dahulu).     Simpan suspensi tersebut selama 1 hari pads temperatur 20° C dalam kubator gelap. Saringlah suspensinya dengan kertas sating biasa, kira-kira 50 ml air saringan dipakai untuk pembenihan. Air saringan tersebut me ngandung antara 10' sampai 10⁹ organisms yang hidup per ml. Benih tei sebut berlaku selama beberapa jam, atau beberapa hari jika disimpan kulkas.Adaptasi : Kalau air sampel mengandung zat organis yang khusus dan "nonbiodegradable" (sulit dipecah oleh bakteri), misalnya yang berasal dari industri kimia atau petrokimia, maka inkubasi tanah harus diteruskan sampai 3,4 atau 5 hari supaya bakteri-bakteri dapat menyesuaikan diri terhadap senyawa sampel tersebut. Bakteri yang telah dapat menyesuaikan diri terhadap suatu jenis air buangan jugs dapat ditemui pada lumpur saluran drainase, lumpur sungai dekat dengan pem buangan air limbah tersebut, pads sebuah sistem pengolahan mikrobiologis (besar maupun instalasi laboratorium) dan se­bagainya. Lumpur atau air buangan diambil lalu disaring tanpa inkubasi. Air saringan tersebut sudah mengandung be­nih yang cocok bagi jenis air buangan tersebut.
i.       Air pengencer (laruten kerja) :
     Hitunglah berapa volum air pengencer yang dibutuhkan untuk melaksa­nakan sejumlah analisa BOD yang direncanakan (lihat A.2.3). Tuangkan­lah ke dalam botol atau jirigen sebanyak liter air suling dan tambah per liternya, 1 ml dari masing-masing larutan b, c, d, e, (dan j), serta kurang lebih 10 mg bubuk inhibitor nitrifikasi. Sesuaikan pH pads pH 7,0 ± 0,1. Campuran dikocok lalu diaerasikan selama 1 jam (kalau volum > 10 1, diperlukan 2 jam). Suhunya sebaiknya sekitar 20° C. 1 jam sebelum tes BOD dimulai, ditambah 1 ml larutan benihan dari butir h. Air pengencer diganti setiap minggu.
j.       Larutan Na_{t S03} (natrium sulfit) hanya untuk air yang mengandung se­nyawa klor aktip.
Cara kerja.1.   Sampel yang bersifat_,Asam atau basa harus dinetralkan sampai pads pH 7,0 ± 01 dengan menggunakan asam atau basa.
2.     Sampel yang diduga mengandung sisa klor aktip (yang dapat menghalangi proses mikrobiologis) harus ditentukan konsentrasi klor aktipnya (lihat Bab 6). Per mol klor aktip yang dikandung sampel, dibutuhkan satu mol zat pereduksi, seperti Na_{t S03,} Na_t ^S2 ⁰3 dan sebagainya.
3.   Sampel yang diduga, mengandung zat beracun : lihat A.1.3. Bab ini..4. Sampel yang mengandung oksigen yang melebihi kejenuhannya (terlalu jenuh), misalnya lebih dari 9 mg ⁰2 A pads 20° C, perlu diturunkan ka­dar oksigennya dengan cars pengocokan. Keadaan tersebut dapat terjadi pads sampel yang ditumbuhi ganggang.
5. Pengenceran sampel :     Oleh karena jumlah oksigen dalam botol terbatas, maksimum 9 mg 02 /1 tersedia, dan sebaiknya oksigen terlarut pads akhir mass inkubasi antara 3 dan 6 mg ⁰2 A, maka sampel perlu diencerkan.
Karena kadar BOD tidak diketahui terlebih dahulu, beberapa pe­ngenceran harus dicoba secara serempak agar supaya setelah inkubasi se-lama 5 hari paling sedikit 1 sampel masih mengandung antara 3 dan 6 mg 02 /1. Dengan demikian analisa setiap sampel memerlukan :-          3 pengenceran R, S dan T (atau lebih banyak kalau BOD sampel ti­dak dapat ditaksir sama sekali).-          1 blanko (untuk menentukan BOD air pengencer).Ada 2 cara untuk menaksir pengenceran yang cocok :a. Bila COD sampel telah diketahui, maka taksiran kadar BOD yang terdekat adalah sebagai berikut (lihat taoel 10.1 untuk prinsip­nya) .R (rendah)        sampel sedikit"oersifat "biodegradable"^BOD                                 0,16 x COD;R (rendah)S (edang)          sampel cukup bersifat "bioclegrable"^RODS _(sedang)                0,32 x COD,T (inggi)            sampel sangat bersifat "biodegrable"BOD T(inggi)       = 0,65 x COD,Kemudian tentukan derajat pengenceran P sesuai dengan taksiran BOD seperti tercantum dalam 

Tabel 10.2.Tabel 10.2. Derajat pengenceran P sesuai jenis air baku untuk tes BODs



b.         Bila COD sampel tidak diketahui sebelumnya. Untuk.menaksir pengenceran P yang cocok, lihat Tabel 10.2. Minimum diharap­kan 3 derajat pengenceran. Misalnya, bila sampel air sungai yang diduga tercermar oleh zat organs, maka taksiran BODnya ber­ada sekitar 15 dan 60 mg ₀₂ /liter sehingga dipilih P = 0,25; 0,125 dan 0,0625. Bagaimana kalau setelah inkubasi 5 hari BODnya ternyata lebih tinggi dari yang diduga, misalnya sampai mencapai 125 mg ₀₂ /liter? Memang, 3 tes yang telah dikerja­kan tidak dengan derajat P yang cukup tinggi hingga semua ok­sigen pads botolnya habis setelah 5 hari dan tidak ada hasil ! Tes BOD Bering tidak dapat diulang lagi, karena pencemaran su­ngai telah berakhir (misalnya pencemaran yang disebabkan oleh pencucian tangki di pabrik terjadi satu kali sebulan).
Supaya pengambilan sampel efisien, sebaiknya jumlah pe­ngenceran cukup banyak hingga salah satu dari pengenceran da­pat memberikan hasil yang tepat; namun cara lebih terjamin adalah dengan pemeriksaan COD lebih dahulu (lihat butir a). Pe­meriksaan COD tidak dapat dihindari kalau air buangan industri yang hendak diperiksa tak dapat ditaksir lebih dahulu.
6.      Dari cara pemilihan derajat pengenceran P, tiga atau lebih derajat pe­ngenceran dipilih. Bila salah satu derajat pengenceran adalah P = 0,25, maka 2 liter larutan sampel yang sudah diencerkan harus disiapkan yang terdiri dari 500 ml sampel asli dan 1500 ml air pengencer (Tabel 10.2.). 2 botol BOD diisi dengan larutan tersebut (larutan R), satu untuk anali­sa pads saat t = 0, yaitu botol R, , dan yang satu lagi untuk analisa pads saat t = 5 hari yaitu botol R2 - Pengenceran "S" yang berikutnya dibuat dengan memindahkan 1 liter larutan "R" ke dalam labu takar 2 liter dan pengisiannya sampai penuh dengan 1 liter air pengencer. Dua botol TOD diisi dengan larutan "S" ini. Larutan "T" dibuat dengan memin­dahkan 1 liter larutan "S" ke dalam labu takar 2 liter, lalu diisi sampai penuh dengan air pengencer . (Kalau jumlah pengenceran diinginkan le­bih banyak, cara sama dapat diteruskan). Dua botol BOD diisi dengan larutan "T" ini. Dua botol BOD diisi dengan air pengencer (larutan kerja) Berta be­nihnya berlaku sebagai blanko. BODs blanko sdharusnya antara 0,5 dan 2 mg ₀₂ It. Awas : gelembung udara tidak boleh berada dalam. botol!7.      Botol-botol BOD (sampel dan blanko) lalu disimpan dalam inkubator (suhu 20° C ± V C) selama kira-kira 1 jam. Kalau suhu larutan tersebut sebelumnya lebih tinggi daripada 20° C, maka akan terjadi penurunan volum dalam botol. Setelah 1 jam botol tersebut dibuka sebentar lalu diisi dengan air pengencer sehingga di dalam botol tertutup tidak ada gelembung udara.8.    Separuh dari jumlah botol-botol BOD tersebut lalu disimpan terns da­lam inkubator (suhu 20^*± 1°C) selama 5 hari. Separuhnya dikeluarkan untuk analisa oksigen terlarut.
Juga kalau jumlah sampel BOD lebih banyak (yang memakai air pengen­cer yang sama), 2 blanko tersebut cukup. Supaya lebih teliti, duplikat blanko dapat dibuat.


Pengecekan ketelitian pelaksanaan analisa BOD.
Analisa BOD adalah penting dan bermanfaat, walaupun analisanya tidak sebegitu mudah dan Bering dilaksanakan secara kurang teliti. Seorang laboran atau mahasiswa bare yang ingin mengerjakan banyak analisa BOD, sebaiknya mengecek cara, kerjanya dengan metoda pengecekan di bawah ini.
Larutan standard dibuat dengan melarutkan. pada ± 0,5 liter air suling di da­lam labu takar 1 liter:
·        750 g glukosa, monohidrat ( BM = 198 )
·        750 g asam L — glutamik garam-Na monohidrat ( BM = 187)
·         1,21 g KH₂ ^PO4
·         1,06 g K2 HPO4·      0,10 g MgSO_4. 7H₂ O·         0,01 g _FeC13. 6H² O·         0,10 g CaC12.
Tambahkan larutan NaOH atau H2 _SO4 sampai pH = 7,0 ± 0,1, kemudi­an encerkan dengan air suling sampai 1 liter. Larutan tersebut bersifat tetap dan mengandung kadar COD = 1270 mg 0₂ /­liter (BOD₅ = 0,65 x 1270 = 825 mg ₀₂ /liter). Larutan standard ini masih harus ditambah benih serta inhibitor nitrifikasi, supaya reaksi mikrobiologis berjalan secara, optimal.
Hasil pengecekan harus dalam batas lebih atau kurang 5 % dari angka BOD teoretis yang disebut atas. Kalau tidak, berarti cara kerja di laborato­rium serta persiapan benih, kurang sempurna. Laboran (mahasiswa) masih harus menyempurnakan cara kerja yang telah dilakukannya.

I.    PERHITUNGANBOD₅ ²⁰ = (X_O — X₅) - (Bo — B₅ ) (1 - P )/PBODI   sebagai mg O₂/l,
X_o = OT (oksigen terlarut) sampel pads saat t = 0 (mg O₂ /l);
X₅ = OT sampel pads saat t=5hari (mg O₂/1);
B_o = OT blanko pads saat t = 0 (mg O₂/ l);B₅ = OT blanko pads saat t=5 hari (mg O₂/l);P = derajat pengenceran.


DAFTAR PUSTAKASumestri Sri. Metode Penelitian Air.